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廣州競遠(yuǎn)生物科技有限公司
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| 分子水平實驗（3） |
雙熒光素酶報告基因檢測
實驗原理
通過將感興趣的目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件構(gòu)建到帶熒光素酶( firefly luciferase)的表達(dá)載體，如pGL3，構(gòu)建成報告基因質(zhì)粒，使這段DNA序列調(diào)控 luciferase的轉(zhuǎn)錄。然后將報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，并加入底物熒光素后(luciferin)， luciferase可以催化熒光素發(fā)出熒光，從而可以通過測量熒光值的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。為避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時效率的差異帶來的誤差，可以同時轉(zhuǎn)入 Renilla?芡光酶素的報告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參，即雙熒光報告系統(tǒng)。該實驗可以用于研究轉(zhuǎn)錄因子對promoter或 enhancer序列的調(diào)控，也可以用于研究受體活性，細(xì)胞內(nèi)信號通路，或者 MICRORNA對基因表達(dá)的調(diào)控。
應(yīng)用
1.澘在啟動子/啟動子核心區(qū)域檢測
2.澘在增強子/抑制子等調(diào)控子核心元件檢測
3.啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點檢測
4.啟動子/增強子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用;
5.病毒/細(xì)胞相互作用;
6.藥物等化學(xué)誘導(dǎo)因素對啟動子活性的調(diào)節(jié)(抑制或增強);
7.射線等物理誘導(dǎo)因素對啟動子活性的調(diào)節(jié)(抑制或増強)
8. MICRORNA靶基因驗證。
染色質(zhì)免疫共沉淀相關(guān)服務(wù)
實驗原理
染色質(zhì)免疫共沉淀( Chromatin Immunoprecipitation，ChIP技術(shù)主要是用于研究DNA和蛋白質(zhì)的相互作用。染色質(zhì)主要是由組蛋白和纏繞在上面的DNA組成。在染色質(zhì)上還結(jié)合了許多轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑相關(guān)蛋白和非編碼RNA。染色質(zhì)上結(jié)合的蛋白或者組蛋白上不同的共價修飾可以通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，或者招募相關(guān)的因子來調(diào)控基因的表達(dá)。通過ChIP技術(shù)，我們可以研究不同的組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子以及染色質(zhì)上結(jié)合的一些其他蛋白，在基因組上的分布。
ChIP實驗的主要原理是，當(dāng)DNA和蛋白結(jié)合或者距離很近時，通過甲醛固定交聯(lián)，在DNA和蛋白分子之間形成共價鍵。將染色質(zhì)通過超聲波破碎或者徴球菌核酸酶處理，打斷成小片段，然后通過特異性的ChIP級別抗體，富集目的蛋白。經(jīng)過逆交聯(lián)處理之后，消化水解目的蛋白，回收得到目的DNA，從而得到與目的蛋白相互作用的DNA信息。
整體實驗流程
1.細(xì)胞交聯(lián)
2.抗體有效性檢測
3.免疫共沉淀
4.建庫測序/PCR驗證
樣本要求
動物細(xì)胞:3x107～5x107，1％的甲醛交聯(lián)，干冰運輸。
動物組織:0.5-2g，對于較大的組織，先切成1-5mm的組織塊，干冰運輸。
植物組織:5-20g，干冰運輸。
抗體需要提前驗證滿足ChIP或者IP實驗要求。
生物信息分析內(nèi)容
標(biāo)準(zhǔn)信息分析
1.去接頭污染，去低質(zhì)量 reads和測序質(zhì)量評估
2.ChIP測序序列與參考基因組序列的比對
3.C |
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