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廣州競遠(yuǎn)生物科技有限公司
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手 機(jī)：18028560893  |
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| 分子水平實(shí)驗(yàn)（2） |
病毒包裝
1.慢病毒包裝
服務(wù)簡介
慢病毒( Lentiviruses)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科。慢病毒( Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷1型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細(xì)胞、長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，因此成為導(dǎo)入外源基因的有力工具�，F(xiàn)在慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細(xì)胞系的基因過表達(dá)、RNA干擾、 MICRORNA研究以及活體動物實(shí)驗(yàn)中。我公司提供慢病毒載體構(gòu)建、RNAi( SHRNA)、 MIRNA、過表達(dá)和干抗慢病毒包裝以及基于慢病毒技術(shù)的穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建服務(wù)。靈敏度更高。
整體實(shí)驗(yàn)流程
1.構(gòu)建質(zhì)粒
a.慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)増引物，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)，采用PCR技術(shù)(采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為09％)從模板中(cDNA質(zhì)粒或者文庫)調(diào)取目的基因CDS區(qū)( coding sequence)連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。
b.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建合成 SIRNA對應(yīng)的DNA須環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體。
c. MIRNA載體構(gòu)建從 genomic中調(diào)取基因相應(yīng)的Mir前體，并在調(diào)取引物中引入酶切位點(diǎn)。2.共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞
3.收集病毒
4.病毒轉(zhuǎn)化、濃縮
5.病毒感染活性鑒定
6.成果交付
質(zhì)量控制
我們會對每一批病毒都進(jìn)行滴度檢測，嚴(yán)格控制質(zhì)量，讓你百分百放心。針對用攜帶熒光報(bào)告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒生產(chǎn)的病毒，我們會先用熒光法檢測病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)率，如能達(dá)到使用要求，再進(jìn)一步采用qPCR法檢測病毒滴度。
2.腺病毒包裝
實(shí)驗(yàn)原理
腺病毒( Adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70-90nm的病毒顆粒，為線狀雙鏈DNA分子，約含35000bp，兩端各有長約100bp的反向重復(fù)序列
腺病毒為5型血清型腺病毒，缺失了腺病毒的早期表達(dá)基因序列E1區(qū)和E3區(qū)。E1是腺病毒復(fù)制所必須的，E1的缺失使其不能自身復(fù)制，只能依靠包裝細(xì)胞如HEK293細(xì)胞提供的反式互補(bǔ)進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，以此保證腺病毒的安全性。E3基因表達(dá)的蛋白能對抗宿主的抗病毒防御系統(tǒng)，E3區(qū)的去除能減少宿主的體內(nèi)免疫反應(yīng)。
腺病毒包裝采用的是*新的 Admax:系統(tǒng)，通過Cre-loxp重組酶，使共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中的腺病毒載體穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒(腺病毒基因組質(zhì)粒)在重組酶的作用下產(chǎn)生重組腺病毒，獲得的病毒滴度更高，其病毒滴度可以達(dá)到1×10^12 pfu/ml
腺病毒載體有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、等多種啟動子可供選擇;而且還有EGFP、 ZSGRE、Tomato、 mcherry、EYF等多種熒光標(biāo)記蛋白可供選擇。
3.腺病毒相關(guān)病毒包裝
實(shí)驗(yàn)原理
腺相關(guān)病毒( adeno- associated virus，AAV)，也稱腺伴隨病毒，屬于微小病毒科依賴病毒 |
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